Исследование предполагает, что проникновение SARS-CoV-2 требует кислого pH

В недавнем исследовании, опубликованном в PNAS , исследователи провели отслеживание одиночного вириона в режиме реального времени в трех измерениях, чтобы изучить механизмы и требования прикрепления мембраны и слияния коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) с клеткой-хозяином. .

Фон

Инфекция SARS-CoV-2 начинается с прикрепления вирусного шиповидного белка к рецептору ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) на мембране клетки-хозяина. Проникновение вируса в клетку может осуществляться двумя путями в зависимости от метода протеолиза шиповидного белка.

Расщепление шиповидного белка активирует механизм вирусного слияния. Это расщепление может происходить на поверхности клеточной мембраны под действием двух трансмембранных сериновых протеаз TMPRSS2 или TMPRSS4 после протеолитической активации фурином в клетках-продуцентах, что приводит к нековалентно присоединенной рецептор-связывающей субъединице S1 и слитой субъединице S2.

Расщепление также может происходить за счет эндосомального поглощения и действия эндосомальных катепсинов . Понимание процесса обработки шиповидных белков и действия специфических протеаз поможет разработать улучшенные и целенаправленные методы лечения SARS-CoV-2.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи разработали новый метод прямой визуализации и отслеживания в реальном времени слияния мембран клеток-хозяев и высвобождения содержимого одним вирионом в трех измерениях. Они использовали химерный вирус, состоящий из вируса везикулярного стоматита (VSV) с эндогенным геном гликопротеина (G), замененным шиповидным белком от SARS-CoV-2. Они также модифицировали структурный фосфопротеин (P) репликативного ядра VSV, чтобы он содержал усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) для отслеживания высвобождения содержимого вириона в клетку.

Белок S также помечен конъюгированным флуоресцентным красителем, что также позволяет визуализировать высвобождение субъединицы S1 в режиме реального времени. Химеры VSV-eGFP-SARS-CoV-2 были созданы для штамма Wuhan-Hu-1, а также для штаммов Delta (B.1.617.2) и Omicron (B.1.1.529). Анализы на инфицирование химерами VSV-eGFP-SARS-CoV-2 проводили на клетках, выращенных в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты) и гидроксидиназора для модулировать рН.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-PCR) с праймерами, нацеленными на рибонуклеиновую кислоту (РНК)-зависимую РНК-полимеразу SARS-CoV-2, использовалась для визуализации степени репликации вируса. Они также провели аналогичные анализы с человеческими изолятами SARS-CoV-2. Кроме того, роль эндосом в опосредованной шиповидным белком инфекции SARS-CoV-2 была исследована с использованием клеток с мутированным геном динамина, который играет важную роль в эндоцитозе.

Полученные результаты

Результаты исследования выявили неизвестное ранее требование определенного диапазона pH от 6,5 до 6,8 для успешного слияния клеточной мембраны и высвобождения частиц вириона из цитозоля вирионом SARS-CoV-2. Это открытие также подчеркнуло роль эндосом в процессе заражения SARS-CoV-2. Пути слияния, расщепления и высвобождения с участием сериновых протеаз TMPRSS2 или TMPRSS4 изначально считались независимыми от эндосом. Однако требование кислого рН указывает на участие эндосом в высвобождении содержимого вириона, независимо от отщепления субъединицы S1 от субъединицы S2 протеазами.

В результатах обсуждаются три пути проникновения вируса SARS-CoV-2 в клетку-хозяина, зависящие от кислого pH. Вирионы с шиповидными белками, расщепленными сериновой протеазой, подвергаются поглощению и перемещению к ранним эндосомам, где кислый рН ранних эндосом способствует высвобождению содержимого вириона в цитоплазму. Вирионы с расщепленными катепсином шиповидными белками подвергаются поглощению и расщеплению в больших эндосомальных компартментах и ​​высвобождают содержимое в цитозоль клетки-хозяина, опосредованное низким рН эндосомальных компартментов.

Третий путь приводит к высвобождению содержимого вириона на поверхность клетки, если прикрепление к мембране происходит при рН от 6,5 до 6,8. Исследование также показало, что субъединица S1 отделяется от шиповидного белка во время образования тримера с рецепторами ACE2 на клеточной мембране. Это предполагает удлиненный промежуточный пептид слияния S2 на мембране клетки-хозяина при нейтральном pH, чтобы удерживать вирион прикрепленным к поверхности клетки до эндоцитоза. Результаты также показали, что шиповидный белок варианта Omicron был более устойчивым к протеолитическому расщеплению фурином.

Выводы

Результаты исследования свидетельствуют о рН-зависимом вирусном тропизме вирионов SARS-CoV-2 в слизистой оболочке дыхательных путей. Клетки в полости носа, экспрессирующие TMPRSS2, могут способствовать быстрому проникновению SARS-CoV-2, поскольку pH слизистой оболочки носа составляет от 6,2 до 6,8. Вирусы, которые сталкиваются с клетками слизистой оболочки легких с более нейтральным pH, вероятно, подвергаются поглощению посредством эндоцитоза. Расширенный промежуточный продукт S2 при нейтральном pH представляет собой потенциальную мишень для терапевтического действия по борьбе с инфекцией SARS-CoV-2.